Real time RT-PCR法による遺伝子検査 の原理 - TA ～ NTO メモしよう ♪

もう随分離れていますが、PCR / RT-PCR法 の復習。
実は、今更ですが・・・
Surgical Mask vs N95 Respirator for Preventing Influenza Among Health Care Workersを読んでいます^^;

一応、「ブタインフルエンザウイルスHA (H1）遺伝子特異的 real time RT-PCR法（quantitative RT-PCR）
による遺伝子検査」の理解に、必要な事項をまとめました。

PCR （polymerase chain reaction：ポリメラーゼ連鎖反応）
ポリメラーゼを用いて、微量の目標 DNA を100万倍まで増幅させる方法。
（この PCR 法 に貢献した キャリー・マリスが1993年にノーベル賞！）

（反応過程）
①まず二本鎖DNAを変性
②アニーリング
プライマーと呼ばれる目的DNAの上流と下流領域の特定部位のみ反応する塩基が、鋳型DNAに結合
③耐熱性ポリメラーゼ反応
上記プライマーが鋳型DNAと相補的な塩基を持つ塩基が順次結合する重合反応。

RT-PCR
微量なメッセンジャーRNA(mRNA)の発現を逆転写酵素reverse transcriptase: RTを用いて検出。

（反応過程）
①RTを用いてRNAを鋳型としたDNAの合成反応（逆転写反応）をあらかじめ行う。
②そのDNAを鋳型としてPCRする。

Real-time PCR

• 定量PCR（Q-PCR）のひとつ。
• ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) による増幅を経時的（リアルタイム）に測定することで、増幅率に基づいて鋳型となるDNAの定量を行なう。

（定量方法）
①二本鎖DNAに特異的に挿入（インターカレート）して蛍光を発する色素 (SYBR green) を用いる方法

• あらゆる配列に対して同じ試薬を用いることができ汎用性が高い。
• プライマー二量体のような非特異的な二本鎖DNAも計測してしまう欠点があり。

②増幅するDNA配列に特異的なオリゴヌクレオチドに蛍光色素を結合させたプローブを用いる方法。

• 特異的な配列をもつ蛍光プローブを作成する必要がある
• 任意の配列を特異的に定量できる利点あり。

参考
PCR / RT-PCR法（GEヘルスケアバイオサイエンス社）
Real-time PCR（タカラバイオ株式会社）

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